一、光学显微镜的组成结构
光学显微镜包括光学系统和机械装置两大部分,而数码显微镜还包括数码摄像系统,现分述如下:
(一)机械装置
1.机架显微镜的主体部分,包括底座和弯臂。
2.目镜筒位于机架上方,靠圆形燕尾槽与机架固定,目镜插在其上。根据有否摄像功能,可分为双目镜筒和三目镜筒;根据瞳距的调节方式不同,可分为铰链式和平移式。
3.物镜转换器它是一个旋转圆盘,上有3~5个孔,分别装有低倍或高倍物镜镜头。转动物镜转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路。
4.载物台是放置玻片的平台,其中央具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹,用来夹住载玻片。右下方有移动手柄,使载物台面可在XY双方向进行移动。
5.调焦机构利用调焦手轮可以驱动调焦机构,使载物台作粗调和微调的升降运动,从而使被观察物体对焦清晰成像。
6.聚光器调节机构聚光器安装在其上,调节螺旋可以使聚光器升降,用以调节光线的强弱。
(二)光学系统
1.目镜它是插在目镜筒顶部的镜头,由一组透镜组成,可以使物镜成倍地分辨、放大物像,例如10X、15X等。按照所能看到的视场大小,目镜可分为视场较小的普通目镜,和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。较高档显微镜的目镜上还装有视度调节机构,操作者可以方便快捷地对左右眼分别进行视度调整;此外,在这些目镜上可以加装测量分划板,测量分划板的象总能清晰地调焦在标本的焦面上;并且,为了防止目镜被取走以及减少运输中被损坏的可能性,这些目镜可以被锁定。
2.物镜它安装在转换器的孔上,也是由一组透镜组成的,能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数,主要有10X、40X、60X、100X等。高倍物镜中多采用浸液物镜,即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体(如杉木油),它能显著的提高显微观察的分辨率。
3.光源有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。
4.聚光器包括聚光镜、孔径光阑。聚光镜由透镜组成,它可以集中透射过来的光线,使更多的光能集中到被观察的部位。孔径光阑可控制聚光器的通光范围,用以调节光的强度。
(三)数码摄像系统
1.摄像头
2.图像采集卡
3.软件
4.微机
(四)显微镜的能力
显微镜的能力包括数值孔径、分辨率、放大率和焦点深度。
① 数值孔径是物镜和被检样品之间的介质的折射率(n)与物镜所接受的光锥顶角的一半α(半孔径角)正弦的乘积。N.A.= n•sinα(香柏油 n =1.52)。N.A.越大,显微镜的显微能力越强。
② 分辨率以分辨两个点的Zui短距离表示。R = 0.61×λ / N.A. 显微镜的鉴别距离越小,显微能力越强。
③ 放大率 = 物镜放大率×目镜放大率×摄影透镜放大率。
④ 焦点深度:在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。
物镜的数值孔径与分辨率成正比,与焦点深度成反比。焦点深度与物镜的数值孔径和总放大率成反比。
二、光学显微镜的分类
光学显微镜有多种分类方法:按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜;按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜;按观察对像可分为生物和金相显微镜等;按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等;按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等;按接收器类型可分为目视、数码(摄像)显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。
倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。
由于上述样品特点的限制,被检物体均放置在培养皿(或培养瓶)中,这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长,能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此,物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来,故称为"倒置显微镜"。
由于工作距离的限制,倒置显微镜物镜的Zui大放大率为60X。一般研究用倒置显微镜都配置有4X、10X、20X、及40X相差物镜,因为倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需要,也可以选配其它附件,用来完成微分干涉、荧光及简易偏光等观察。
目见倒置显微镜广泛应用于patch-clamp,transgeneICSI等领域。
三、光学显微镜的使用规程
(一)实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置,镜座应距桌沿6~7cm左右。
(二)打开光源开关,调节光强到合适大小。
(三)转动物镜转换器,使低倍镜头正对载物台上的通光孔。先把镜头调节至距载物台1~2cm左右处,然后用左眼注视目镜内,接着调节聚光器的高度,把孔径光阑调至Zui大,使光线通过聚光器入射到镜筒内,这时视野内呈明亮的状态。
(四)将所要观察的玻片放在载物台上,使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央,然后用标本夹夹好载玻片。
(五)先用低倍镜观察(物镜10X、目镜10x)。观察之前,先转动粗动调焦手轮,使载物台上升,物镜逐渐接近玻片。需要注意,不能使物镜触及玻片,以防镜头将玻片压碎。然后,左眼注视目镜内,同时右眼不要闭合(要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯,以便在观察的同时能用右眼看着绘图),并转动粗动调焦手轮,使载物台慢慢下降,不久即可看到玻片中材料的放大物像。
(六)如果在视野内看到的物像不符合实验要求(物像偏离视野),可慢慢调节载物台移动手柄。调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰,可以调节微动调焦手轮,直至物像清晰为止。
(七)如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。一般具有正常功能的显微镜,低倍物镜和高倍物镜基本齐焦,在用低倍物镜观察清晰时,换高倍物镜应可以见到物像,但物像不一定很清晰,可以转动微动调焦手轮进行调节。
(八)在转换高倍物镜并且看清物像之后,可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低,使光线符合要求(一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时,视野要稍变暗一些,所以需要调节光线强弱)。
(九)观察完毕,应先将物镜镜头从通光孔处移开,然后将孔径光阑调至Zui大,再将载物台缓缓落下,并检查零件有无损伤(特别要注意检查物镜是否沾水沾油,如沾了水或油要用镜头纸擦净),检查处理完毕后即可装箱。
四、光学显微镜的维护
(一)必须熟练掌握并严格执行使用规程。
(二)取送显微镜时一定要一手握住弯臂,另一手托住底座。显微镜不能倾斜,以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。
(三)观察时,不能随便移动显微镜的位置。
(四)凡是显微镜的光学部分,只能用特殊的擦镜头纸擦拭,不能乱用他物擦拭,更不能用手指触摸透镜,以免汗液玷污透镜。
(五)保持显微镜的干燥、清洁,避免灰尘、水及化学试剂的玷污。
(六)转换物镜镜头时,不要搬动物镜镜头,只能转动转换器。
(七)切勿随意转动调焦手轮。使用微动调焦旋钮时,用力要轻,转动要慢,转不动时不要硬转。
(八)不得任意拆卸显微镜上的零件,严禁随意拆卸物镜镜头,以免损伤转换器螺口,或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦。
(九)使用高倍物镜时,勿用粗动调焦手轮调节焦距,以免移动距离过大,损伤物镜和玻片。
(十)用毕送还前,必须检查物镜镜头上是否沾有水或试剂,如有则要擦拭干净,并且要把载物台擦拭干净,然后将显微镜放人箱内,并注意锁箱。